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CRISPR技術簡介及運用
CRISPR/Cas9技術簡介
CRISPR/Cas系統是在大多數細菌（40%）和古細菌（90%）中發現的一種天然免疫系統，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。
CRISPR指的是規律成簇的間隔短回文重復（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。 Cas（CRISPR-associated genes）為CRISPR相關基因。
當噬菌體感染細菌后，病毒DNA進入細菌細胞，細菌細胞表達Cas復合體對噬菌體DNA進行切割得到間隔序列，間隔序列在cas1 和cas2作用下插入到CRISPR最前端（如圖Phase1）形成免疫。
當噬菌體再次感染細菌時，以較為簡單的Type II型CRISPR/Cas系統為例，細菌表達 tracrRNA、前體crRNA及Cas9蛋白（RNA引導的核酸內切酶），tracrRNA和crRNA由于部分序列互補而結合，Cas9與tracrRNA和crRNA形成復合體并由Cas9加工成為成熟crRNA-tracrRNA Cas9復合體，成熟復合體由間隔序列引導識別病毒靶序列，并切斷病毒DNA（如圖Phase2）。復合體只能識別與間隔序列一致并且3'端含PAM（protospacer adjacent motif原間隔序列鄰近模塊序列，如不同來源CRISPR/Cas9系統有不同序列，如鏈球菌CRISPR/Cas9系統PAM序列未NGG）的靶序列，即PAM原間隔序列鄰近模塊序列，這是CRISPR/Cas9不剪切自身間隔序列的原因。
2013年1月，在Science上發表了兩篇以鏈球菌CRISPR/Cas9系統為基礎對哺乳動物細胞進行基因組編輯新方法，利用一條gRNA（guid RNA）模擬成熟的 crRNA-tracrRNA復合體與Cas9共同作用切割靶基因組（如下圖），由此揭開了該技術的運用高潮。
到目前為止CRISPR/Cas已經運用到了各種細胞以及大腸桿菌、釀酒酵母、擬南芥、煙草、高粱、水稻、小麥、線蟲、果蠅、蠶、斑馬魚、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、豬、羊等，從最低等的微生物到哺乳動物的基因敲除修飾或突變，另外一方面其強大的基因組編輯能力已經用于生物治療，如 HIV HBV等RNA病毒引起的疾病治療研究，單基因或多基因遺傳病治療研究，癌癥治療研究等方面。
CRISPR/Cas相比其它基因組編輯技術，如鋅指核酸酶（ZFNs）或轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs），操作更簡單，同時更容易針對同一細胞中的多個基因位點進行編輯，該系統可成為替代目前基因組工程方法的一種更安全，毒性更低的新方法。
CRISPR技術運用：
CRISPR技術可運用于各種細胞，各個物種基因敲除，敲入，修飾或突變等，另外利用失去核酸酶活的Defect Cas9與不同功能結構域融合，可以實現基因干擾，激活，染色體染色，特定DNA純化等特殊功能。
1、基因敲除（Gene Knockout）
利用雙剪切或同源重組直接移除miRNA/lncRNA基因序列或蛋白編碼基因的關鍵外顯子，使其發生移碼突變，從而使靶基因功能完全丟失。
2、基因敲入（Gene Knockin）
通過基因斷裂誘導的同源重組，選擇性將靶基因敲入Rosa26位點（人細胞選擇敲入類似基因THUMPD3-AS1），靶基因可以是小RNA，lncRNA或蛋白編碼基因，條件性敲入還可實現基因表達的實時控制。
3、基因修飾/突變（Gene Modification/Mutation）
通過基因斷裂誘導的同源重組，可以在原基因中插入報告基因或標簽序列，實現目的基因的檢測、追蹤和功能研究；也可以改變原有基因的編碼序列來研究其對基因功能的影響。
4、基因編輯以外的運用（Other Applications）
利用dCas9（Defect Cas9）與特殊功能蛋白結構域的融合表達，還可使其發揮特殊功能。與轉錄激活或轉錄抑制蛋白結構域的融合表達，還可實現特定基因的過表達或干擾；與熒光蛋白的融合表達，可用于染色體染色；與表面抗原的融合，可用于純化特定基因組片段等。
實驗數據
使用方法
應用實例
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